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細(xì)胞表面抗原檢測(cè)一般步驟
更新時(shí)間:2019-08-21   點(diǎn)擊次數(shù):1566次

細(xì)胞表面抗原檢測(cè)一般步驟

1.實(shí)驗(yàn)材料:檢測(cè)管或96微孔板 一抗(FITC標(biāo)記),以表記Anti-CD19/FITC抗體為例

緩沖液:PBS(PH7.4)

設(shè)備:移液器、離心機(jī)、冰盒或冰箱、流式細(xì)胞儀

2. 注意事項(xiàng):標(biāo)記抗體在使用之前用PBS溶解并振勻,并確認(rèn)沒有沉淀,迅速離心幾秒,使所有的液體都集中到管底,標(biāo)記抗體應(yīng)避光4℃保存,避免凍結(jié),因樣本的固定保存或較長(zhǎng)時(shí)間放置可能會(huì)影響細(xì)胞表面分子和抗體之間的結(jié)合,故建議盡可能使用新鮮樣品。

3. 操作方法:

一. 以大鼠淋巴組織細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)步驟為例

樣品制備:

取出大鼠淋巴組織塊,迅速浸泡在10ml的緩沖液中,并用注射器的活塞研磨或使用兩塊預(yù)冷的載玻片研壓成單細(xì)胞。

把懸液轉(zhuǎn)移到50ml的錐形管中靜置片刻,使細(xì)胞團(tuán)塊和碎片沉降到管底,并通過尼龍網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。

在4℃下300-400g離心4-5分鐘,除去上清液。

如果該樣品為脾臟細(xì)胞,加入一定量的RBC lysis裂解紅細(xì)胞,或者用分離液分離出淋巴細(xì)胞。若為其它樣品,不用此步驟。

加入50ml 緩沖液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù),根據(jù)需要用臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

離心細(xì)胞液并除去上清;用適量的緩沖液重懸細(xì)胞為2×107個(gè)/ml。采用直接標(biāo)記的一抗,則加入CD19/FITC抗體(0.5-1ug/106細(xì)胞)冰上孵育5-10分鐘。

細(xì)胞熒光染色步驟:

1. 在每個(gè)流式檢測(cè)管或板式微孔中加入50ul的稀釋后的一抗;在空白管/孔或同型對(duì)照管/孔中加入50ul 緩沖液。若進(jìn)行抗體*濃度測(cè)試,建議范圍2-0.03ug/106細(xì)胞。

2. 在各管/孔中分別加入50ul細(xì)胞懸液(約106細(xì)胞),并輕輕混勻。

3. 避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。 (注意:有些抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間,建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索)

4. 孵育完成后,加入緩沖液(每流式檢測(cè)管中加2ml,而每微孔中加200ul) 4℃下300-400g離心5分鐘,并棄去上清。

5. 重復(fù)洗滌過程3次。

6. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。

7. 使用直接標(biāo)記一抗,用500ul 緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體,則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素(用緩沖液稀釋成合適的濃度)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞兩次(參考第4步和第5步方法)。之后500ul緩沖液重懸細(xì)胞,并上機(jī)檢測(cè)。

8. 試驗(yàn)結(jié)果分析:(注:若要對(duì)多個(gè)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行多色標(biāo)記,則同時(shí)加入熒光標(biāo)記抗體后按以上操作步驟進(jìn)行孵育和細(xì)胞洗滌;操作盡量保持在避光和4℃左右的溫度下進(jìn)行)

二.以人外周血細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)步驟為例

1. 在每個(gè)流式檢測(cè)管或板式微孔中加入50ul的熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)稀釋后的一抗(抗體用緩沖液稀釋成合適的濃度);在空白管/孔或同型對(duì)照管/孔中加入50ul 緩沖液。

2. 每管分別加入100ul全血,并輕輕混勻。

3. 避光孵育15-30分鐘。 (注:有些結(jié)合能力較低的抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間,建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索)

4. 每管分別加入2ml RBC lysis Buffer(之前預(yù)熱恢復(fù)至室溫),混合均勻。

5. 室溫避光孵育10分鐘,此孵育時(shí)間不要超過15分鐘。

6. 室溫300-400g離心5分鐘,并棄去上清。

7. 用2ml 緩沖液洗滌細(xì)胞一次。

8. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。

9. 若使用的一抗是熒光直接標(biāo)記抗體,用500ul 緩沖液或2%的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體,則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素(用緩沖液稀釋成合適的濃度)后于室溫避光孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞1-2次(參考第7步方法)。之后500ul或2%的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞,并上機(jī)檢測(cè)。

10. 試驗(yàn)結(jié)果分析。 (注:若要對(duì)多個(gè)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行多色標(biāo)記,則同時(shí)加入熒光標(biāo)記抗體后按以上操作步驟進(jìn)行孵育和細(xì)胞洗滌;操作盡量保持在避光條件下進(jìn)行)

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